in vivoトランスフェクションAteloGene® Local & Systemic Useの調製 | 株式会社高研

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AteloGene® Local Use & Systemic Use調製方法

操作

「AteloGene®」とsiRNAの混合液を調製する方法は、局所投与用、全身投与用共通です。また、このページ中の ①-⑦は、製品ページの「キットの内容」と対応しています。 尚、siRNA/miRNAの分解を防ぐため、RNaseの無い環境での作業を心掛けてください。

1)「AteloGene®」の準備

⑥18G 注射針を①「AteloGene®」充填済みプレフィルドシリンジ に装着し、④マイクロチューブに全量600µLを吐出する。その後は、マイクロチューブを氷冷し続ける。

作業中のロスも考慮し、④マイクロチューブに600µLが吐出されるよう、過剰量の「AteloGene®」が①「AteloGene®」充填済みプレフィルドシリンジ に充填されている。

2)siRNA/miRNA溶液の調製

局所投与用で5-10µM、全身投与用で20-40µMのsiRNA/miRNA溶液600µLを調製する。

a.siRNA/miRNAストック溶液を使用する場合
②10×siRNAバッファーと③滅菌水を用いてバッファー濃度が1×になるようにsiRNA/miRNA溶液の濃度を調製する。その後、氷冷する。

b.凍結乾燥siRNA/miRNAを使用する場合
②10×siRNAバッファーと③滅菌水を用いて1×濃度のsiRNAバッファーを調製する。これを用いてsiRNA/miRNA 溶液の濃度を調製する。その後、氷冷する。

TEバッファーなどの他のバッファーに溶けているsiRNA/miRNA溶液も使用可能だが、最良の結果を得るためには付属の②10×siRNA バッファーの使用を推奨する。

3)「AteloGene® QG」とsiRNA/miRNA複合体の調製

氷冷しながら、600 µLのsiRNA/miRNA 溶液をマイクロチューブに入っている“AteloGene®” の上にゆっくりと重層する。その後、4℃で20分間ゆっくりと転倒混和する。尚、気泡の形成を避けるため回転速度は4 r.p.m程度にする(ローテーターの直径が20cmの場合)。

4)混合液の脱泡、投与準備

10,000 r.p.m. 、4℃で1分間遠心し、脱泡を行う。その後、⑥18G 注射針を⑤ディスポーザブルシリンジ に装着し、気泡の形成を避けるためゆっくりと吸引してから、注射針を ⑦26G注射針に取り換える。